首先，根据待测样品的性质，选择对其有较强保留能力的固定相，若待测样品带负电荷,可用阴离子交换填料,反之则用阳离子交换填料。若为中性待测物,可用反相填料萃取。spe小柱或滤膜的大小与规格应视样品中待测物的浓度大小而定。对于浓度较低的体内样品,一般应选用尽量少的固定相填料萃取较大体积的样品。
活化
萃取前先用充满小柱的溶剂冲洗小柱或用5-10ml溶剂冲洗滤膜使spe填料保持湿润,因为填料干燥会降低样品保留值，而各小柱的干燥程度不一,也会影响回收率的重现性。先用甲醇等水溶性有机溶剂冲洗填料,因为甲醇能润湿吸附剂表面,并渗透到非极性的硅胶键合相中,使硅胶更容易被水润湿；然后再加入水或缓冲液冲洗，创造和样品溶剂相容的环境并提高回收率。
上样
一般可采取以下四种方法：
(1)用0.1mol/l酸或碱调节,使ph9,离心取上层液萃取；
(2)用甲醇、乙腈等沉淀蛋白质后取上清液,以水或缓冲液稀释后萃取；
(3)用酸或无机盐沉淀蛋白质后取上清液,调节ph值后萃取；
(4)超声15min后加入水、缓冲液,取上清液萃取。流速应控制为1ml/min,流速快不利于待测物与固定相结合。
淋洗
反相spe的清洗溶剂多为水或缓冲液,可在清洗液中加入少量有机溶剂、无机盐或调节ph值。加入小柱的清洗液应不超过一个小柱的容积,而spe滤膜为5～10ml。
洗脱
应选用5～10ml离子强度较弱但能洗下待测物的洗脱溶剂。若需较高灵敏度,则可先将洗脱液挥干后,再用流动相重组残留物后进样。体内样品洗脱后多含有水,可选用冷冻干燥法。保留能力较弱的spe填料可用小体积、较弱的洗脱液洗下待测物,再用极性较强的hplc分析柱如c18柱分析洗脱物。若待测物可电离,可调节ph值,抑制样品离子化,以增强待测物在反相spe填料中的保留,洗脱时调节ph值使其离子化并用较弱的溶剂洗脱,收集洗脱液后再调节ph值使其在hplc分析中达到*分离效果。在洗脱过程中应减慢流速,用两次小体积洗脱代替一次大体积洗脱,回收率更高