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细胞裂解液各成分的作用与制备过程

2024/3/18 21:04:27发布12次查看
细胞裂解液各成分的作用:
1、第一种50mmol/l tris-hcl是缓冲液,保证细胞裂解时ph值也能稳定,tris是一种有机碱。
2、第二种1.0 mmol/l edta是一种金属螯合剂。
3、第三种150 mmol/l nacl是等渗体系电解质,用于协调细胞膜内外离子平衡。
4、第四种0.1% sds是十二烷基硫酸钠,是一种表面活性剂和还原剂,有增溶作用。
制备细胞裂解液实验流程:
1. 收集胰蛋白酶消化的细胞并离心,用pbs清洗。
2. 用100μl 裂解缓冲液冰浴溶解沉淀10min(每500000个细胞20μl裂解缓冲液)。
3. 10000rpm,4°c离心10min,取上清转移至新管。
4. 用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。
5. 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml,每小瓶中放100μl,-80°c储存。
6. 按照1:1体积比混合2×样品缓冲液,煮沸5min后,室温放置5min。
7. 短时离心后点样电泳检测。
溶液准备:
裂解缓冲液:
0.15m nacl, 5mm edta(ph 8.0), 1% triton×100, 10mm tris-cl(ph 7.4); 使用前加 5mm dtt, 0.1mm pmsf 异丙醇和
5mm ε-氨基己酸
2×样品缓冲液:
130mm tris-hcl(ph8.0), 20%(v/v)甘油, 4.6%(w/v)sds, 0.02%溴酚蓝, 2%dtt
pbs(ph7.4):
10mm na2hpo4, 1.8mm kh2po4, 50mm nacl, 2.7mm kcl
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