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非洲分枝杆菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒使用步骤

2024/3/16 11:47:02发布31次查看
非洲分枝杆菌探针法荧光定量pcr检测试剂盒使用步骤:
一、样品dna的制备
用自选方法提取细菌样品dna。注意:dna纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品dna,后面的pcr再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备o157:h7标准曲线(以10-10e6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体病毒做阳性对照,只提供没有传染性的、可以直接使用的dn段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2和1号。
2. 用带芯枪头分别加入45 μl超纯水(用带芯枪头,下同)。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用te缓冲液或超纯水10倍梯度稀释到10e7拷贝/μl(注:请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至10e7拷贝/μl,建议每次稀释10倍,梯度稀释至10e7拷贝/μl)。
4. 在6号管中加入5 μl 10e7拷贝/μl的o157:h7阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得10e6拷贝/μl的阳性对照。
5. 换枪头,从6号管中取5 μl溶液到5号管中,充分震荡1分钟,得10e5拷贝/μl的阳性对照。
6. 换枪头,从5号管中取5 μl溶液到4号管中,重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。
7. nc管中不加任何阳性对照。
8. 从1-6号管中分别取5 μl和待测样品一起进行定量pcr(见下步),每个样品做3次重复。pcr后得到每个阳性对照稀释样品的荧光pcr ct值,并以之为纵轴,以浓度的对数值为横轴,绘制标准曲线。
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