1、染色过强
a、 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜
b、 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度
c、 dab显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
a、 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟
b、 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%h2o2封闭孵育时间延长
c、 组织中含内原性生物su正常非免疫动物血清再封闭
d、 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
a、 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟
b、 试剂超过有效使用时间 应更换试剂
c、 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 （应防止切片干燥）
d、 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜
e、 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟
4、染色阴性
a 、操作步骤错误 应重试 设阳性对照
b、 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果
c、 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误