引物退火温度引物的另一个重要参数是熔解温度（tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链dna分子时的温度。tm对于设定pcr退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的tm低5℃。
设定tm有几种公式。高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。根据gc含量估算tm。确定引物tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的tm值。引物对的tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物tm不同，将退火温度设定为比最di的tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。