1 材料
1.1 仪器
max190全波长酶标仪（美国spectra公司）；l420离 心机（湘仪离心机仪器有限公司）；tankpe060 纯水仪 （美国 millipore 公司）；bsa224s-cw 电子天平[赛多利 斯科学仪器（北京）有限公司]；vortex-5 涡旋混匀仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；eg1150c石蜡包埋 仪（德国徕卡公司）；2000-c倒置显微镜、v.a1倒置荧光 显微镜（德国zeiss公司）。
1.2 药品与试剂
人工蝉花由本实验室栽培，由南京中医药大学药学院于瑞莲副教授鉴定为蝉花（isaria cicadae miquel）菌 种的人工栽培品；5-fu注射液（天津金耀药业有限公司， 批号：1605081，规格：0.25 g/10 ml）；大鼠内毒素（et）酶 联免疫吸附（elisa）试剂盒（批号：h03a8e48592）、d乳酸（d-la）elisa试剂盒（批号：h02f4e48101）、分泌型 免疫球蛋白（siga）elisa试剂盒（批号：h13c3e76192）、 肿 瘤 坏 死 因 子 α（tnf-α）elisa 试 剂 盒（批 号 ： h06a2e50672）、γ-干扰素（ifn-γ）elisa 试剂盒（批号： h06f6e23206）、白细胞介素15（il-15）elisa试剂盒（批 号：h03a3f06703）、粒细胞集落刺激因子（g-csf）elisa试剂盒（批号：h05a7e46872）、髓过氧化物酶（mpo） elisa 试剂盒（批号：h03f8e34274）、丙二醛（mda） elisa 试剂盒（批号：h04a6e40382）、闭锁小带蛋白 zo-1 elisa 试剂盒（批号：h03a2e78452）均购自上海 源叶生物科技有限公司；dapi染色液（南京建成生物有 限公司，批号：sub- 30162）；兔源紧密连接蛋白claudin 1-一抗（批号：ab240400）；山羊抗兔免疫球蛋白（igg）二 抗（批号：ab150077）均购自美国abcam公司。
1.3 动物
spf级健康sd大鼠40只，♂，体质量（215±35）g， 由南京市青龙山动物繁殖场提供，动物生产许可证号： scxk（苏）2017-0008。所有大鼠饲养于南京中医药大 学实验动物房内，环境温度为（23±2）℃、12 h/12 h昼夜 循环。饲养期间大鼠自由进食、饮水，适应性饲养1周后 进行实验。本实验遵守《实验动物护理和使用指南》，符 合动物常规伦理。
2 方法
2.1 动物分组与造模
将40只sd大鼠随机分为正常组、模型组和人工蝉 花高、中、低剂量组，每组8只。除正常组外，模型组和人 工蝉花各剂量组大鼠均每天腹腔注射 1 次 30 mg/kg 的 5-fu，正常组大鼠腹腔注射等量生理盐水，持续注射5 d。在此同时，人工蝉花高、中、低剂量组大鼠在注射 5-fu后1 h分别灌胃3.5 、1.75 、0.875 g/kg的人工蝉花溶 液（将干燥人工蝉花粉末用生理盐水制备的悬液，剂量 根据预实验结果和本实验室前期研究报道设置），正常 组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水；各组大鼠均每天 给药 1 次，连续给药 8 d，记录大鼠体质量等一般情况 变化。
2.2 血清中et、d-la含量测定
末次给药后2 h，大鼠腹主动脉取血，室温静置1 h，凝固收缩后，3 000 r/min 离心 10 min，分离血清，然后 于－20 ℃保存，备用。按相应试剂盒说明书操作，检测 血清中 et、d-la 的含量，考察其对小肠黏膜生物屏障 功能的影响。
2.3 血清中siga、tnf-α、ifn-γ、il-15含量测定
取“2.2”项下血清，按相关试剂盒说明书操作，对血 清中siga、tnf-α、ifn-γ、il-15的含量进行测定，考察其 对小肠黏膜免疫功能的影响。
2.4 血清中mpo活性测定
取“2.2”项下血清，按试剂盒说明书操作，对血清中 g-csf的含量进行测定。大鼠取血后，腹腔解剖取小肠 组织约40 mg匀浆[组织与生理盐水比为1 ∶ 10（mg/ml）]， 用于试剂盒检测，剩余部分病理组织检查待用。按检测 试剂盒说明书操作，对小肠组织中mpo活性进行测定， 考察其对小肠炎症因子的影响。
2.5 小肠组织中mda含量测定
取“2.4”项下小肠组织，按检测试剂盒说明书操作， 对小肠组织中mda的含量进行测定，考察其对小肠组 织过氧化水平的影响。
2.6 小肠黏膜病理学观察
将小肠于10％多聚*固定24 h，然后进行常 规组织包埋、石蜡切片等操作，经苏木精-伊红（he）染色 后显微镜下观察小肠黏膜病理变化。
3 结果
给药前，各组大鼠间体质量差异均无统计学意义（p＞0.05）。给药 8 d 后，与正常组比较，模型组大鼠体 质量显著降低（p＜0.01），此外还出现了明显的食欲不 振、精神萎靡、活力下降等症状。与模型组比较，人工蝉 花高剂量组大鼠体质量均显著升高（p＜0.01），食欲不 振、精神萎靡等情况也得到明显改善。与正常组比较，模型组大鼠血清中 et、d-la 含量 显著升高（p＜0.01）。与模型组比较，人工蝉花高、中、 低剂量组大鼠血清中 et、d-la 含量均显著降低（p＜ 0.05或p＜0.01），且呈剂量依赖性趋势。与正常组比较，模型组大鼠小肠组织中mda含量 显著升高（p＜0.01）。与模型组比较，人工蝉花高、中、 低剂量组大鼠小肠组织中 mda 含量显著降低（p＜ 0.01），并呈剂量依赖性趋势。正常组大鼠肠腔绒毛形态完整，隐窝结构清晰。模 型组大鼠肠绒毛剥落明显，隐窝结构散乱，可观察到大 量炎性细胞聚集，肠黏膜损伤严重。与模型组比较，人 工蝉花高、中、低剂量组大鼠的肠腔绒毛和隐窝结构形 态较完整，损伤程度较小；其中，人工蝉花高剂量、中剂 量组大鼠肠绒毛已接近正常，人工蝉花高剂量组大鼠隐 窝结构较为紧密、完整，人工蝉花低剂量组大鼠小肠组 织隐窝结构虽较正常组有一定程度的破坏、中性粒细胞聚集，但相比于模型组结构仍较好。
4 讨论
正常的肠道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫 屏障和生物屏障共同组成。通过对肠黏膜病理切片的 观察，发现5-fu之后，大鼠小肠绒毛和隐窝结构均 受到了严重的损伤，导致肠黏膜屏障功能受到严重的影 响，机体无法正常地进行营养吸收，表现为体质量下降 和血清中et含量显著升高。d-la是肠道细菌代谢、裂 解的产物，当肠道缺血时，肠黏膜生物屏障破坏，此时肠 道中细菌产生的大量d-la，通过受损的肠黏膜经循环 进入血液，检测血中d-la水平可以反映肠黏膜受损程 度和通透性变化。本研究结果显示，模型组大鼠血清 中d-la含量显著升高，灌胃人工蝉花后，肠黏膜得到明 显保护，血清中et和d-la含量均显著降低，并且大鼠 因造成的体质量下降的情况也有显著的改善，表明 人工蝉花对5-fu后破坏的肠黏膜营养吸收以及肠 黏膜生物屏障有明显的保护作用。
免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在时间进行处理。