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标准的pcr反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dntp混合物 各200umol/l
引物 各10～100pmol
模板dna 0.1～2ug
taq dna聚合酶 2.5u
mg2+ 1.5mmol/l
加双或三蒸水至 100ul
pcr反应五要素： 参加pcr反应的物质主要有五种即引物、酶、dntp、模板和mg2+
引物： 引物是pcr特异性反应的关键，pcr 产物的特异性取决于引物与模板dna互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板dna序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用pcr就可将模板dna在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：g+c含量以40-60%为宜，g+c太少扩增效果不佳，g+c过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致pcr失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物 量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种taq dna聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的pcr反应约需酶量2。5u(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dntp的质量与浓度 dntp的质量与浓度和pcr扩增效率有密切关系，dntp粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dntp溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1m naoh或1m tris。hcl的缓冲液将其ph调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dntp降解。在pcr反应中，dntp应为50～200umol/l，尤其是注意4种dntp的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低pcr产物的产量。dntp能与mg2+结合，使游离的mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是pcr成败与否的关键环节之一，传统的dna纯化方法通常采用sds和蛋白酶k来消化处理标本。sds的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，sds 还能与蛋白质
结合而沉淀； 蛋白酶k能水解消化蛋白质，特别是与dna结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于pcr反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于pcr扩增。rna模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶k法，要防止rnase降解rna。
mg2+浓度 mg2+对pcr扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的pcr反应中，各种dntp浓度为200umol/l时，mg2+浓度为1.5～2.0mmol/l为宜。mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低taq dna聚合酶的活性，使反应产物减少。
pcr反应条件的选择
pcr反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于pcr原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链dna在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在taq dna 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延
伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度taq dna酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不是导致pcr失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板dna变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或pcr产物变性，就会导致pcr失
败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响pcr特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板dna 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度
、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，g+c含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
tm值(解链温度)=4(g+c)＋2(a+t)
复性温度=tm值-(5～10℃)
在tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高pcr反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间结合。
③延伸温度与时间：taq dna聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/s/酶分子
70℃ 60核苷酸/s/酶分子
55℃ 24核苷酸/s/酶分子
高于90℃时， dna合成几乎不能进行。
pcr反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。pcr延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的dna片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定pcr扩增程度。pcr循环次数主要取决于模板dna的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。