1.吸出培养基，用pbs清洗两遍，应*清除培养基，否则会影响胰酶的消化作用；
2.加入2-3ml胰酶（75cm规格培养瓶）至培养瓶中，放入37℃恒温培养箱中，消化2-3min，显微镜下观察细胞形态由梭形变为圆形，立即加入3-6ml*培养基终止消化；
3.用吸管轻柔吹打内壁数次帮助细胞脱落，将细胞悬液收集至15ml离心管中，1000rpm离心6-8min，
4.沿细胞沉淀方向缓慢倾倒液体，加入500μl的培养基重悬，用加样枪将细胞悬液移至冻存管内；
5.在冻存管内加入等量冻存液，为避免dmso对细胞的损伤过大，冻存液应一滴一滴的加入，后混匀。
6.直接装入冻存盒内，放入-80℃冰箱；