1、引物长度：一般为15～30个碱基，引物太短会降低扩增特异性。引物过长退火温度会提高，不利于反应的发生。
2、引物序列：设计引物时碱基要随机分布，避免碱基或核苷酸的重复导致错误引发；引物间和引物自身序列也要尽量避免互补，防止形成引物二聚体或发夹结构。
3、碱基分布：gc含量一般40-60%，含量过高或过低都不利于进行反应。其含量过低会使引物不稳定；过高会引发非特异性扩增。
4、 tm值：引物的tm值（解链温度）=4（g+c）+2（a+t），尽可能保证上下游引物的tm值一致，一般不超过2℃。
5、 引物设计好后进行blast检查，检测是否与基因组中重复序列或其它基因位点有交叉同源；
6、 引物的特异性：引物的3'端如果含有一个g或c残基能增加引物的特异性。