（一）原理
pcr扩增获得双链dna产物经变性形成单链,测序引物与其中一条模板链上的互补序列退火
退火的引物在低进行性反应条件下(如低温和低ntp浓度),通过dna聚合酶催化作用延伸~个核苷酸;由于此反应体系中掺入放射性标记的ntp,能使新合成的dna链中含有多个放射性标记,便于产生高放射显影度
标记的dna链在高进行性反应条件下,通过dna聚合酶催化进行延伸,通过在反应体系中掺入 ntp,使链延伸反应终止
反应产物经过电泳分离和放射自显影,就可以进行序列判读
（二）材料
()dna模板pcr产物离子交换色谱纯化,作为dna模板,浓度为:~l
()引物个核苷酸的dna引物可以不经过纯化,直接用作测序引物,引物浓度l
()dna聚合酶要求该酶在低温条件下仍具有活性,以便有效地在新合成的dna链中掺入放射性标记
比如usb a生产的测序酶
()测序反应缓冲液根据测序酶具体而定,如测序酶的反应缓冲液可用lt-hc(h ), l mci, f l nc
()放射性标记的ntp一般为[p]atp、[p]atp或[s]atp
（三）方法
()制备链延伸终止反应混合物分别在个微量离心管中各加入一种 ntpntp的混合物,其中ntp和ntp浓度分别为l和l,℃预热
()制备退火混合物在一个微量离心管中加入pcr扩增dna,测序引物;测序反应缓冲液,用水调整至总反应体积
在加热仪内~℃加热后,迅速放入冰浴中冷却(适合于双链dna模板),或者在加热仪内℃加热后在加热仪内自然冷却到℃(适合于单链dna模板)
离心后在冰浴中冷却,并迅速进行下一步操作
()标记反应在退火混合物中加入预冷的ntp混合物(含ttp、gtp和ctp各l,c的[p]atp),lddt,现稀释的测序酶u,并用水将反应体系调整到,混匀后在冰上孵育,放射性标记新合成的dna链
()链延伸终止反应将标记混合物分别加入管链延伸终止反应混合物中,℃进行链延伸终止反应
()终止反应体系在各管中加入终止液(%甲酰胺, l edta,%溴酚蓝,%二甲苯腈蓝ff),终止反应
样品可以一℃保存~
电泳前在电热仪上℃加热
()电泳分离和放射自显影每一泳道上样~;,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
p标记的需要过夜曝光显影,若用p标记的需要~曝光显影,读片
（四）注意事项
①标记反应最为关键,应在低进行性反应条件下进行
退火后引物只被延伸~个核苷酸,并在新合成的dna链中掺入多个放射性标记
对高gc碱基含量的dna模板,可用[p]ctp代替[p]atp
②对高gc碱基含量的dna模板,链延伸终止反应混合物中应用-脱氧gtp替代gtp,以消除电泳过程由于压缩现象产生的假带