实验材料 大肠杆菌
试剂、试剂盒 cacl2氨苄青霉素lb
仪器、耗材 离心机分光光度计摇床
实验步骤
1. 接种一个单菌落于50 ml lb培养液中，于37℃摇床培养过夜（250 r/min）。
2. 往一个2 l 的烧瓶中加入400 ml lb培养液，再加入4 ml 过夜培养液，于37℃；摇床，培养至od590为0.375。
3. 将培养液分装到8个50 ml 预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~10 min，然后于4℃，1 600 g 离心7 min。
4. 细胞沉淀用10 ml 冰冷的cacl2溶液重悬，于4℃，以1 100 g 离心5 min 。
5. 细胞沉淀用10 ml 冰冷的cacl2溶液重悬，冰上放置30 min，于4℃，1 100 g 离心5 min。
6. 用2 ml 冰冷的cacl2溶液重悬各管细胞，然后按每管250 ul 的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中，立即冻存于- 70℃。
7. 按照以下各步骤用10 ng pbr322转化100 ul 感受态细菌。
8. 将合适体积的转化物涂于含有氨苄青霉素的lb平板上，37℃培养过夜。
9. 将10 ng 加入到一个15 ml 无菌的圆底试管中，并放置冰上。
10. 将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。
11. 立即将100 ul 感受态细菌加 入到管中，轻轻旋动，并放置冰上10 min 。
12. 将管故入42℃水浴2 min 进行热休克，然后加入1 ml lb 培养液于每一支试管中。
13. 于37℃置滚筒式摇床口培养1 h。
14. 将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上，于37℃培养12~16 h。
收起
注意事项
1.转化菌涂平板前抗生素的量要足够，涂布细菌时菌量不要太多，培养时间不要超过16小时。否则抗生素会失效，未转化菌也会生长。
2.制备感受态细胞的过程中，每一步操作的动作要轻柔，尤其是悬浮细胞时要避免用旋祸混合器。
3.所用的cacl2等试剂均需是纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4℃。
4.整个操作过程均应在无菌条件下进行。
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