实验方法原理
提取组织或细胞中的总rna，以其中的mrna作为模板，采用oligo（dt）或随机引物利用逆转录酶反转录成cdna，再以cdna为模板进行pcr扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。
实验材料 组织细胞
试剂、试剂盒 rna提取试剂dntp 混合物taq dna聚合酶第一链cdna合成试剂盒
仪器、耗材 离心管离心机水浴锅pcr管电泳仪凝胶图像分析系统移液管移液枪离心管盒
实验步骤
一、总rna的提取
见 总rna的提取 相关内容。
二、cdna第一链的合成
目前试剂公司有多种cdna第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以gibicol公司提供的superscripttm preamplification system for first strand cdna synthesis 试剂盒为例。
1． 在0.5 ml微量离心管中，加入总rna 1-5 ug，补充适量的depc h2o使总体积达11 ul。在管中加10 um oligo（dt）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；
2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；
3． 取0.5 ml pcr管，依次加入下列试剂：第一链cdna 2 ul；上游引物（10 pm） 2 ul；下游引物（10 pm） 2 ul；dntp(2mm) 4 ul；10x pcr buffer 5 ul；taq 酶（2 u/ul） 1 ul。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；
4．加入superscriptⅱ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；
5． 于70℃加热15 min以终止反应；
6．将管插入冰中，加入rnase h 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的rna。-20℃保存备用。
三、pcr
1．取0.5 ml pcr管，依次加入下列试剂：第一链cdna 2 ul；上游引物（10 pm）2 ul；下游引物（10 pm）2 ul；dntp(2 mm) 4 ul；10x pcr buffer 5 ul；taq 酶（2 u/ul）1 ul；
2．加入适量的ddh2o，使总体积达50 ul。轻轻混匀，离心；
3．设定pcr程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在pcr扩增目的基因时，加入一对内参（如g3pd）的特异性引物，同时扩增内参dna，作为对照；
4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
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注意事项
1．在实验过程中要防止rna的降解，保持rna的完整性。在总rna的提取过程中，注意避免mrna的断裂；
2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；
3．内参的设定：主要为了用于靶rna的定量。常用的内参有g3pd（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免rna定量误差、加样误差以及各pcr反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；
4． pcr不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标dna起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；
5． 防止dna的污染： 采用dna酶处理rna； 在可能的情况下，将pcr引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mrna的共线性。
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其他
1．反转录酶的选择
（1） money 鼠白血病病毒（mmlv）反转录酶：有强的聚合酶活性，rna酶h活性相对较弱。最适作用温度为37℃；
（2）禽成髓细胞瘤病毒（amv）反转录酶：有强的聚合酶活性和rna酶h活性。最适作用温度为42℃；
（3）thermus thermophilus、thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在mn2+存在下，允许高温反转录rna，以消除rna模板的二级结构；
（4）mmlv反转录酶的rnase h-突变体：商品名为superscript 和superscriptⅱ。此种酶较其它酶能多将更大部分的rna转换成cdna，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mrna模板合成较长cdna。
2．合成cdna引物的选择
（1） 随机六聚体引物：当特定mrna由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mrna。用此种方法时，体系中所有rna分子全部充当了cdna第一链模板，pcr引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cdna中96%来源于rrna。
（2） oligo(dt)：是一种对mrna特异的方法。因绝大多数真核细胞mrna具有3'端poly(a+)尾，此引物与其配对，仅mrna可被转录。由于poly(a+)rna仅占总rna的1-4%，故此种引物合成的cdna比随机六聚体作为引物和得到的cdna在数量和复杂性方面均要小。
（3）特异性引物：最特异的引发方法是用含目标rna的互补序列的寡核苷酸作为引物，若pcr反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mrna 3'端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cdna，导致更为特异的pcr扩增。
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