您好,欢迎来到三六零分类信息网!老站,搜索引擎当天收录,欢迎发信息
免费发信息

细胞核提取的方法介绍

2019-9-11 16:39:34发布6次查看

一、单细胞核提取的方法 1. ficoll分层液法      
ficoll分层液法是一种单次密度梯度离心分离法.聚蔗糖-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液,其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖(商品名为ficoll),分子量为40kd,具有高密度、低渗透压、无毒性的特点.高浓度的ficoll溶液粘性高,易使细胞聚集,故通常使用60g/l的低浓度溶液,密度为1.020,添加比重为1.200的泛影葡胺(urografin)以增加密度.国外常用商品isopaque或hypaque,故又称ficoll-hypaque分层液,将适量340g/l泛影葡胺加入ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液.分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液效果较好,因为人的红细胞密度1.093粒细胞密度为1.092,单个核细胞在1.076~1.090之间.而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同,如小鼠为1.088,马为1.090.分离时先将分层液置试管底层,然后将肝素化全血以hanks液或pbs液作适当稀释后,轻轻叠加在分层液上面,使两者形成一个清晰的界面.水平式离心后,离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带.红细胞和粒细胞密度大于分层液,同时因红细胞遇到ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底.血小板则因密度小而悬浮于血浆中,唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中,呈白膜状,吸取该层细胞递经洗涤高心重悬.本法分离单个核细胞纯度可达95%,淋巴细胞约占90%~95%,细胞获得率可达80%以上,其高低与室温有关,超过25℃时会影响细胞获得率.
2.percoll分层液法       
这是一种连续密度梯度离心分离法.percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(pvp)处理的硅胶颗粒,对细胞无毒性.利用percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理,将密度不等的细胞分离纯化.用percoll原液(密度1.135)与约等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合,高速离心后,使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度,再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上,低速离心后,便得四个细胞层.表层为死细胞残片和血小板,底层为粒细胞和红细胞,中间有两层,上层富含单个核细胞(75%),下层富含淋巴细胞(98%).该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各较好的方法,但操作流程较长,手续较多
二、使用密度梯度离心法提取细胞核 操作步骤 
1.用颈椎脱位的方法处死小白鼠后,迅速剖开腹部取出肝脏,剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9%nacl的烧杯中,反复洗涤,尽量除去血污,用滤纸吸去表面的液体。
2.将湿重约1g的肝组织放在小平皿中,用量筒量取8ml预冷的0.25mol/l蔗糖一0.003mol/l氯化钙溶液,先加少量该溶液于平皿中,尽量剪碎肝组织后,再全部加入。
3.剪碎的肝组织倒入匀浆管中,使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中,左手持之,右手将匀浆捣杆垂直插入管中,上下转动研磨3~5次,用3层纱布过滤匀浆液于离心管中,然后制备一张涂片①,做好标记,自然干燥。
4.将装有滤液的离心管配平后,放入普通离心机,以2500rpm,离心15分钟;
(1)缓缓取上清液,移入高速离心管中,保存于有冰块的烧杯中,待分离线粒体用;
(2)同时涂一张上清液片②做好标记,自然干燥;
(3)余下的沉淀物进行下一步骤。
5.用6ml0.25mol/l蔗糖一0.003mol/l氯化钙溶液悬浮沉淀物,以2500rpm离心15分钟弃上清,将残留液体用吸管吹打成悬液,滴一滴于干净的载玻片上,涂片③,自然干燥。6.将①、②、③涂片用l%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。
北京索莱宝科技有限公司是生化试剂供应商,专业生产销售生化试剂、生物试剂、细胞培养基、实验耗材等产品。细胞核提取试剂盒为索莱宝自产产品,其货号为sn0020。细胞核提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的细胞核。适合于动物软组织(肝或脑组织)和硬组织(肌肉)以及培养细胞的细胞核的制备。其制备物产量高,可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶,性能稳定。

该用户其它信息

VIP推荐

免费发布信息,免费发布B2B信息网站平台 - 三六零分类信息网