摘要：【目的】比较雌、雄海马对小鼠抗疲劳和改善记忆障碍的不同作用。【方法】转棒实验检测小鼠抗疲劳能 力，将小鼠分3组，1组喂食普通饲料，另外2组分别喂食含有质量分数0.22%雌、雄海马的饲料，共喂食6周。 跳台实验检测小鼠记忆能力，将小鼠为4组，正常组与乙醇组喂食普通饲料，另外2组分别喂食含有质量分数0.22% 雌、雄海马的饲料，共喂食6周。体积分数30%乙醇灌胃乙醇组和雌、雄海马组诱导小鼠记忆损伤模型。【结果】 抗疲劳实验中，与对照组相比，喂食雄海马的小鼠在棒时间显著延长（尸<0.05)，其血清中乳酸含量显著降低（p <0.05);而喂食雌海马的小鼠在棒时间和血清乳酸含量均无明显改变。乙醇记忆损伤实验中，与对照组相比，模 型组小鼠跳下平台的潜伏期显著下降（尸<0.01)，错误数（次）显著升高（尸<0.01);与模型组相比，喂食雄海 马的小鼠跳下平台的潜伏期显著升高（尸<0.05)，错误数（次）显著减少（尸<0.05)，脑组织中的乙酰胆碱酯酶 活性显著降低（尸<0.05);而喂食雌海马的小鼠上述指标均无改变。【结论】在增强小鼠抗疲劳能力和改善记忆方 面，雄海马的功效显著而雌海马无效。
关键词：雌、雄海马；抗疲劳；gai善记忆
随着现代生活节奏的加快，疲劳的产生对人们 生活质量产生了越来越大的影响。延缓疲劳发生， 迅速消除疲劳，对人们身体健康极为重要[1]。学习 记忆是大脑重要功能之一，也是人类赖以生存和进 化的关键。由外力、环境污染以及酒精等引起的记 忆损伤，特别是因酒精引起的记忆损害越来越多， 会严重危及人类的正常生活工作，造成严重经济负 担。由于海洋的独特环境，许多海洋药物具有高效 的活性和特殊的药理作用机制，在抗疲劳和记忆改 善方面的作用日益受到人们的重视[2]。
海马入药历史悠久，药理作用广泛，除性激素 样作用[3-4]外，还具有抗炎[5]、抗氧化、抗疲劳和抗 癌[6]、抗抑郁[7]等作用。三斑海马能显著延长小鼠 负重游泳时间，减少运动过后的乳酸生成并加速乳 酸代谢，其抗疲劳效果优于人参[8]。“深海龙”是一 种含有海马有效成分的水丸，服用后能显著提高人 体无氧功率、定量负荷以及极限负荷工作能力[9]。 药理研究发现海马水、醇提取物能在一定程度上改 善记忆[10]。小鼠妊娠晚期，一次性灌胃谷氨酸单钠， 可明显降低60日龄仔鼠y迷宫学习记忆能力[11]。 从三斑海马中分离出的一种肽类初制剂，可拮抗谷 氨酸单钠的上述作用[12]。三斑海马中分离出的一种 小分子多肽能抵抗ap诱导的神经毒性，有望治疗 老年痴呆[13]。此外，海马富含dha、epa①-3多不 饱和脂肪酸对大脑有很好保护作用的成分[14]。
目前对《中国药典》2015版收录的5种高药用 价值海马的研究，主要是三斑海马，但三斑海马养 殖较为困难，难以满足市场需求。而线纹海马因抗 病能力强、存活率高、生长速率快优点[15]，成为近 年来的养殖shou选。同时线纹海马较三斑海马异亮氨 酸、亮氨酸、甲硫氨酸以及精氨酸含量高，这些成 分对维护机体健康，增强免疫力有重要作用[16]。目 前关于线纹海马的研究主要集中在抗炎[17]方面，且 传统中药习惯将线纹海马雌雄配对入药[18]，单雄性 或单雌性海马功效研究尚未见报道。本研究以单雌 性和单雄性海马饲喂小鼠，利用转棒实验和急性乙 醇记忆损伤模型，分析雌、雄海马对小鼠增强疲劳 耐受和改善记忆的功效，并通过测定血清中乳酸 (la)含量反映小鼠疲劳程度，脑组织中乙酰胆碱 酯酶（ache)以及乙酰胆碱转移酶（chat)活性 反映小鼠与学习记忆有关的胆碱能系统变化，以期 进一步阐明线纹海马功效的机制，为线纹海马保健 品和药品开发研究提供依据。
1材料与方法
1.1材料
无特定病原体（spf级）六周龄雄性昆明种小 鼠，体质量22〜24 g，购自济南朋悦实验动物繁育 有限公司（合格证号：37⑻92⑻008874 )。小鼠饲 养于spf级动物房，温度(23±1 )c，湿度(50±10 )%， 12 h光照（7: 00—19:⑻），自由饮食和摄水。小 鼠适应环境7d后开始实验，此时小鼠体质量均值 为33 g。线纹雌海马、线纹雄海马，由深圳市万骐 海洋生物科技有限公司提供。yls-4c转棒式疲劳 仪，济南益延科技发展有限公司；xr-3tb跳台实 验系统，上海欣软信息科技有限公司；高速冷冻台 式离心机，beckman公司；rt-61⑻酶标仪，rayto
公司。无水乙醇，成都市科龙化工试剂厂。elisa 试剂盒la、ache、chat，产品批号分别为 20170705536t、 20170711258t、 20170702163t，由
江苏雨桐生物科技有限公司提供。海马饲料由海马 粉末与普通粉末饲料按比例混合均勻，混合后的饲 料4c下储存，小鼠食用饲料每天更新，避免海马 氧化。
1.2万法
1.2.1实验分组海马抗疲劳实验共分3组（《 = 15):对照组饲喂普通饲料，雌海马组饲喂质量分 数0.22%的雌海马饲料，雄海马组饲喂质量分数 0.22°%的雄海马饲料。海马记忆改善实验共分4组 (« = 15):对照组以及乙醇组饲喂普通饲料，雌海 马组饲喂质量分数0.22%的雌海马饲料，雄海马组 饲喂质量分数0.22%的雄海马饲料。海马粉末不溶 于水，故采取拌饲料喂食的方式，该方法成熟，应 用广泛[19]。两个实验均喂食海马饲料6周，记录初 始体重，之后每周末称重一次。
1.2.2小鼠转棒实验[20]先进行为期3d的适应性 预实验，每天将小鼠放置在转棒疲劳仪上，设置转 棒疲劳仪转速20 r/min，时间10 min。如有小鼠中 途掉落，则将小鼠放回转棒上继续适应。正式实验 中，设定转速40 r/min，记录5 min内小鼠从开始 到掉棒的时间。本实验为一次性测试结果。
1.2.3跳台实验[21]体积分数30%的乙醇以10 ml/kg的剂量在实验前1 h灌胃乙醇组和雌、雄海 马组，造成急性乙醇中毒所致记忆损伤造模。跳台 实验时，将小鼠放置在平台上，自由探索试验箱3 min,后将小鼠放置在箱内铜栅上，铜栅通电(30 ma 恒流）以刺激小鼠找到平台。24 h后正式测试，记 录5 mm内小鼠第一次跳下平台的时间，即潜伏期， 以及5 mm内小鼠跳下平台的总数（次），即错误数 (次)。本实验为一次性测试结果。
1.2.4样品采集转棒实验结束30 min后，小鼠断 头颈部取血，全血静置0.5 h，以转速3⑻0 r/min离 心10 min，保存血清于-80 °c冰箱。跳台实验结束 24 h后，小鼠断头，迅速将全脑剥离，液氮冷冻后 保存于-80 c冰箱。
1.2.5生化指标测定根据elisa试剂盒说明书， 测定抗疲劳实验小鼠血清la含量，记忆障碍实验 小鼠全脑ache和chat活性。
1.2.6数据处理所有数据均用均值±标准误差 (y盨e)表示，spss 19 统计分析，graphpad 作
1.2万法
1.2.1实验分组海马抗疲劳实验共分3组（《 = 15):对照组饲喂普通饲料，雌海马组饲喂质量分 数0.22%的雌海马饲料，雄海马组饲喂质量分数 0.22°%的雄海马饲料。海马记忆改善实验共分4组 (« = 15):对照组以及乙醇组饲喂普通饲料，雌海 马组饲喂质量分数0.22%的雌海马饲料，雄海马组 饲喂质量分数0.22%的雄海马饲料。海马粉末不溶 于水，故采取拌饲料喂食的方式，该方法成熟，应 用广泛[19]。两个实验均喂食海马饲料6周，记录初 始体重，之后每周末称重一次。
1.2.2小鼠转棒实验[20]先进行为期3d的适应性 预实验，每天将小鼠放置在转棒疲劳仪上，设置转 棒疲劳仪转速20 r/min，时间10 min。如有小鼠中 途掉落，则将小鼠放回转棒上继续适应。正式实验 中，设定转速40 r/min，记录5 min内小鼠从开始 到掉棒的时间。本实验为一次性测试结果。
1.2.3跳台实验[21]体积分数30%的乙醇以10 ml/kg的剂量在实验前1 h灌胃乙醇组和雌、雄海 马组，造成急性乙醇中毒所致记忆损伤造模。跳台 实验时，将小鼠放置在平台上，自由探索试验箱3 min,后将小鼠放置在箱内铜栅上，铜栅通电(30 ma 恒流）以刺激小鼠找到平台。24 h后正式测试，记 录5 mm内小鼠第一次跳下平台的时间，即潜伏期， 以及5 mm内小鼠跳下平台的总数（次），即错误数 (次)。本实验为一次性测试结果。
1.2.4样品采集转棒实验结束30 min后，小鼠断 头颈部取血，全血静置0.5 h，以转速3⑻0 r/min离 心10 min，保存血清于-80 °c冰箱。跳台实验结束 24 h后，小鼠断头，迅速将全脑剥离，液氮冷冻后 保存于-80 c冰箱。
1.2.5生化指标测定根据elisa试剂盒说明书， 测定抗疲劳实验小鼠血清la含量，记忆障碍实验 小鼠全脑ache和chat活性。
1.2.6数据处理所有数据均用均值±标准误差 (y盨e)表示，spss 19 统计分析，graphpad 作
1.2万法
1.2.1实验分组海马抗疲劳实验共分3组（《 = 15):对照组饲喂普通饲料，雌海马组饲喂质量分 数0.22%的雌海马饲料，雄海马组饲喂质量分数 0.22°%的雄海马饲料。海马记忆改善实验共分4组 (« = 15):对照组以及乙醇组饲喂普通饲料，雌海 马组饲喂质量分数0.22%的雌海马饲料，雄海马组 饲喂质量分数0.22%的雄海马饲料。海马粉末不溶 于水，故采取拌饲料喂食的方式，该方法成熟，应 用广泛[19]。两个实验均喂食海马饲料6周，记录初 始体重，之后每周末称重一次。
1.2.2小鼠转棒实验[20]先进行为期3d的适应性 预实验，每天将小鼠放置在转棒疲劳仪上，设置转 棒疲劳仪转速20 r/min，时间10 min。如有小鼠中 途掉落，则将小鼠放回转棒上继续适应。正式实验 中，设定转速40 r/min，记录5 min内小鼠从开始 到掉棒的时间。本实验为一次性测试结果。
1.2.3跳台实验[21]体积分数30%的乙醇以10 ml/kg的剂量在实验前1 h灌胃乙醇组和雌、雄海 马组，造成急性乙醇中毒所致记忆损伤造模。跳台 实验时，将小鼠放置在平台上，自由探索试验箱3 min,后将小鼠放置在箱内铜栅上，铜栅通电(30 ma 恒流）以刺激小鼠找到平台。24 h后正式测试，记 录5 mm内小鼠第一次跳下平台的时间，即潜伏期， 以及5 mm内小鼠跳下平台的总数（次），即错误数 (次)。本实验为一次性测试结果。
1.2.4样品采集转棒实验结束30 min后，小鼠断 头颈部取血，全血静置0.5 h，以转速3⑻0 r/min离 心10 min，保存血清于-80 °c冰箱。跳台实验结束 24 h后，小鼠断头，迅速将全脑剥离，液氮冷冻后 保存于-80 c冰箱。
1.2.5生化指标测定根据elisa试剂盒说明书， 测定抗疲劳实验小鼠血清la含量，记忆障碍实验 小鼠全脑ache和chat活性。
1.2.6数据处理所有数据均用均值±标准误差 (y盨e)表示，spss 19 统计分析，graphpad 作
图。参数数据均采用单因素方差分析，进行lsd检 验，非参数数据（跳台潜伏期和抗疲劳行为实验） 均米用 kruskal-wallis 分析，进行 wilcoxon- mann-whitney u-test检验。所有检测指标《 = 15。
2实验结果
2.1雌、雄海马对小鼠体质量影响
图1可知，实验前，各组小鼠体质量没有差异 (p>0.05)。饲养6周后，各组小鼠的体质量均有 增加，但与对照组相比，饲喂雌、雄海马的小鼠体 质量均无显著差异（户>0.05)，说明雌、雄海马对 小鼠的正常生长并无影响。
2.2雌、雄海马饲喂对小鼠抗疲劳耐受时间影响
小鼠从开始到掉棒的持续时间越长，表示小鼠 耐受时间越长，抗疲劳能力越强。图2显示，与对 照组相比，雌海马组的耐受时间无显著差异（户> 0.05 )，雄海马组的耐受时间则显著升高（丑 =7.353, p<0.05 )，说明仅雄海马能增强小鼠抗疲劳能力。
2.3雌、雄海马饲喂对小鼠血清中乳酸la影响
图3显示，雄海马对血清乳酸水平有显著效果 (f(2,42)=3.465, p<0.05)。与对照组相比，雌海 马组的血清la水平无显著差异（p>0.05 )，雄海 马组的血清la水平则显著降低（p<0.05 );与雌 海马组相比，雄海马组的血清la水平也显著降低 (p<0.05)结果表明雄海马能有效降低运动疲劳 后小鼠体内la含量。
2.4雌、雄海马对小鼠跳台潜伏期和错误数（次） 影响
图4显示，雄海马对乙醇诱导的跳台潜伏期有 显著改善效果（万=29.364, p<0.01)。与对照组相 比，乙醇组的潜伏期显著降低（p<0.01);与乙醇 组相比，雌海马组的潜伏期无明显升高（p>0.05)， 雄海马组的潜伏期则显著升高(p<0.01 )。表明30% 乙醇灌胃能造成小鼠记忆损伤，雄海马能显著改善 这种记忆障碍，而雌海马无效。
4雌、雄海马对小鼠跳台潜伏期的影响 effect of female and male sea horse on step-down latency in mice
图5显示，海马对乙醇诱导的跳台错误数（次) 有显著改善效果（f(3,56)=12.315, p<0.01)。与对 照组相比，乙醇组的错误数（次）显著升高（p< 0.01 );与乙醇组相比，雌、雄海马组的错误数（次) 均显著降低（p<0.05)。表明对于乙醇造成的记忆 损伤，雌、雄海马能部分进行改善。
**, vs 对照组 p<0.01; #, vs 乙醇组 p<0.05
**, vs control group p<0.01; #, vs female sea horse group p<0.05
图5雌、雄海马对小鼠跳台错误数（次）的影口向
fig. 5 effect of female and male sea horse on the number of
errors in step-down test in mice
2.5雌、雄海马对小鼠脑内乙酰胆碱酯酶ache和 乙酰胆碱转移酶chat活性影响
图6显示，海马对乙醇诱导的ache活性有显 著改善效果（f(3,56)=13.5 3 5, p<0.05)。与对照组 相比，乙醇组ache活性显著升高（p<0.01);与 乙醇组相比，雄海马组ache活性显著降低（p< 0.05)。结果表明，乙醇能导致小鼠脑内ache活性 上升，雄海马能逆转这一影响
图6雌、雄海马对小鼠脑内乙酰胆碱酯酶活性的影响
fig. 6 effect of female and male sea horse on the brain
activity of ache in mice
图7显示，与对照组相比，乙醇诱导使得脑内 chat 活性显著降低（f(3,56) =5.656,尸〈0.05);但 是与乙醇组相比，雌、雄海马两个组chat活性均 没有变化（尸>0.05)。结果表明，乙醇造成的记忆 损伤会使脑内chat活性下降，但是雌、雄海马对 这一变化并无改善作用。
3讨论
运动耐力是反映机体疲劳最直jie客观的指标， 运动耐力的增强是抗疲劳能力增强的最有力表现。 小鼠转棒实验是一种强迫全身消耗性实验，其运动 时间的长短是衡量疲劳的一个指标[22]。乳酸是机体 在无氧条件下进行糖代谢的终产物，剧烈运动时机 体会产生大量乳酸，乳酸的积累会导致机体疲劳， 可反映机体疲劳程度[23]。在本研究中，雄海马表现 出对血乳酸的清除作用，提高了机体对氧的利用能 力，降低了无氧酵解程度，从而延长了小鼠运动耐 受时间。彭汶铎等[24]也发现小鼠连续14 d灌胃海马 酶解提取物，在一次性运动和递增运动量疲劳模型 中，小鼠血清中乳酸含量均显著降低。但是饲喂雌 海马的小鼠，其耐受时间与血清乳酸含量与对照组 相比，并无明显变化，证明单独的雌海马不能改善 小鼠的运动机能，没有抗疲劳作用。
跳台实验是检测动物学习记忆能力的常用方 法，跳台潜伏期和错误数（次）是评价动物学习记 忆的重要指标。潜伏期长，错误数（次）少，表明 动物的学习记忆能力强。本研究中，30°%乙醇灌胃 对小鼠的学习记忆能力造成了损伤。一次性饮人过量乙醇，能引起中枢神经系统由兴奋转为抑制状 态，首先作用于大脑皮层，然后累及皮层下中枢和 小脑，导致记忆力下降[25]。乙醇对中枢神经系统的 损伤机制比较复杂，其中之一是对胆碱能系统的影 响[26]。而中枢胆碱能系统则与学习记忆密相关，胆 碱能系统的重要神经递质乙酰胆碱（ach)，其释放 量随着学习与记忆、探究行为等认知活动的发生而 随之改变。chat对ach的合成起着催化作用，而 ache则参与脑内ach的分解，使神经递质对突触 后膜的兴奋作用终止，保证神经传递正常。在大脑 内，chat和ache共同维持着ach的动态平衡[27]。 由于ach性质极不稳定，容易水解，故通过检测 chat和ache的活性间接来反映ach的含量。从 实验结果可知，乙醇组chat活性降低，ache活 性升高，即ach分解加快而合成减少，ache总体 水平降低，学习记忆受损。从行为上看，饲喂雄海 马的小鼠其学习记忆有所改善，潜伏期增加，错误 数（次）减少；而饲喂雌海马的小鼠，学习记忆能 力并未改善。生化指标则显示，饲喂雄海马的小鼠 其脑内ache活性与乙醇组相比显著降低，chat 活性则无明显变化，提示雄海马对学习记忆的改善 可能是通过抑制ach分解而非加速其合成，此外在 不同记忆损伤模型小鼠中，利用不同中药如夏天无 和刺五加，均显示可通过抑制ache来达到记忆改 善的效果[28-29];由于雌海马未能改善乙醇造成的学 习记忆损伤，所以与乙醇组相比，饲喂雌海马的小 鼠其脑内chat和ache活性也无改变。
本研究存在以下两点不足：1.评价抗疲劳经典 药效学实验有转棒疲劳和负重游泳，评价记忆改善 的有跳台，避暗及水迷宫实验。目前本实验只各米 用了其中一种方法。2.实验中所用海马为粉末粗材 料，应该找出其中的有效成分进行实验。接下来笔 者及研究团队将对雌、雄海马成分进行更深人的分 析，优化海马提取物，完善实验方案，为更准确、 更好地利用海马资源提供理论依据。
4结论
雄海马可以通过降低体内乳酸含量，增强小鼠 的抗疲劳能力；通过抑制乙酰胆碱酯酶，改善小鼠 的学习记忆能力；而单独的雌海马则没有上述功 能。雄海马在抗疲劳和改善记忆方面的效果显著而 雌海马无效。