（taqman探针一步法实时荧光rt-pcr）
编号：ka.pcr015.01
规格：50头份
介绍：非洲猪瘟(african swine fever，east african swine fever,asf)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100%，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。世界卫生组织（oie）将其列为必须通报疾病。
用途：该试剂盒用于对asf进行检测，有助于对asf的实验室诊断、监测和流行病调查。
原理：本试剂盒采用一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应(one-step real time rt-pcr) ，结合taqman技术，对特异核酸进行定性或定量检测。
试剂盒的组成
试剂名称
数量
asf反应液
550μl×1管
asf酶
40μl×1管
asf引物探针
100μl×1管
无核酸水
1000μl×1管
asf阴性对照
1000μl×1管
asf阳性对照
150μl×1管
保存期及贮藏条件：本产品-20℃避光可保存12个月。
样品收集，操作和储存
1. 最好选择发病早期，无菌采样并立即送往实验室进行病毒检测。
2. 样品短期可在4℃冷藏保存，较长时间保存应在--20℃或者-70℃，并且避免反复冻融。
检测步骤
1.核酸提取
样品进行适当处理后，可采用本公司的核酸提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒rna的提取，请按照提取试剂盒说明书进行操作。也可选择其他合适的商品化产品。
2.扩增试剂的准备
将样品数+1份阴性对照+1份阳性对照设为n，计算试剂所需量，反应体系配制见下表
试剂名称
n份用量（20μl 体系）
asf反应液
10μl×（n+1）
asf酶
0.5μl×（n+1）
asf引物探针
1.8μl×（n+1）
无核酸水
5.7μl×（n+1）
将各试剂按照表中用量加入无菌离心管中，充分混匀，短暂离心后在pcr反应管中分别加入18μl混合液。
3.加样
将制备好的样本，阴性对照，阳性对照各取2μl分别加入对应反应管中，加完后盖紧pcr反应管盖，置于pcr仪上。
4.荧光pcr扩增与信号收集
循环数
温度（℃）
时间
数据收集位点
1
45
15min
-
1
95
2min
-
40
95
15s
-
60
1min
数据收集
注：报告基团选fam,淬灭基团选none。
结果成立原则
阳性对照：ct值＜30并有明显的扩增曲线。
阴性对照：无ct值或者ct值>37，线性为直线或者轻微斜线，无明显扩增曲线。
以上要求需同时满足，否则本次实验无效，需要重新进行。
结果判定
ct值
样本检测结果
<30并有明显的扩增曲线
阳性，样本中检测出asf。
30-37
可疑，需重复检测。若第二次检测ct值仍为30-37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。
>37并无扩增曲线
阴性，样本中未检测出asf。
注意事项
1.反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。
2.pcr整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严禁器材和试剂倒流。
3.使用不含荧光物质的一次性手套，一次性离心管。
4.反复冻融试剂将减低检测灵敏度，本试剂盒应在5次内用完.
5.-20℃保存的各试剂管使用前应在室温下完全融化，液体融化后需彻底混匀，2000 rpm离心15 s ，使用后立即放回-20 ℃。
6.在rna提取过程中，避免rna酶污染，尽量缩短操作时间。
7.注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
8.pcr反应管避免气泡存在，管盖需盖紧。
9.不同批次的试剂盒勿混用。
北京大有泰莱生物技术有限公司
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