elisa原理 --操作规则（新手适用）
酶联免疫吸附实验 elisa
elisa法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为elisa法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此elisa法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
一．实验原理
酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称elisa）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,elisa过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）--待测抗体（抗原）--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。
用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于elisa法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（hrp）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，hrp酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知hrp的a（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指hrp百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是hrp的a（1cm 403nm mg/ml=2.5）hrp纯度（rz）=a403nm/a275nm纯度rz（ｒeinheit zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度hrp的rz值在3.0左右，最高可达3.4。用于elisa检测的hrp的rz值要求在3.0以上。
elisa的基本原理有三条：
（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；
（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
二、实验方法
基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用0.05m ph9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的tmb底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2m硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测o·d值：在elisa检测仪上，于450nm（若以abts显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔o·d值，若大于规定的阴性对照od值的2.1倍，即为阳性。
基本方法二 用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用ddw洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
（二） 酶与底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是elisa成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。
免疫技术常用的酶及其底物
酶
底物
显色反应
测定波长
辣根过氧化物酶
邻苯二胺
橘红色
492*
四甲替联苯胺
黄色
460**
氨基水杨酸
棕色
449
邻联苯甲安
兰色
425
2,2'-连胺基-2（3-乙基-并噻唑啉磺酸-6）铵盐
蓝绿色
642
碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷酸盐（pnp）
黄色
400
萘酚-as-mx磷酸盐+重氮盐
红色
500
葡萄糖氧化酶
abts+hrp+葡萄糖
黄色
405,420
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
深蓝色
β-ｄ－半乳糖苷酶
甲基伞酮基半乳糖苷（4mug）
荧光
360,450
硝基酚半乳糖苷（onpg）
黄色
420
* 终止剂为2mol/l h2so4
** 终止剂为2 mol/l柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。
可催化下列反应： hrp+h2o2→复合物 复合物+ah2→过氧化物酶+h2o+a ah2 ——为无色底物, 供氢体； a—— 为有色产物。
（三） elisa常用的四种方法
1．直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面；
加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；
加底物。底物的降解量＝抗原量。
2．间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面；
加抗体, 形成抗原-抗体复合物；
加酶标抗体；
加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。
3．双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
加抗原，形成抗原-抗体复合物;
加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;
加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）;
加底物。底物的降解量＝抗原量。
4. 竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面;
（1） 加入酶标抗原；
（2）,（3）加入酶标抗原和待测抗原；
加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
三．仪器和材料
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板-酶标板（平板, 40孔, 96孔）。
2. 酶联免疫检测仪，50ul或100ul加样器。
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔igg, 工作稀释度1:1000。
4. 包被液：0.05mol/l ph9.6碳酸盐缓冲液,4℃保存。 na2co3 0.159克, nahco3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。
5. 稀释液：同洗涤缓冲液。 【或者牛血清白蛋白(bsa)0.1g加入洗涤缓冲液至100ml；或者加羊/兔血清与洗涤液配成5-10%】
6. 洗涤缓冲液：0.01mol/l ph7.4 pbs-tween-20, 于４℃保存。 nacl 8g, kh2po4 0.2g, na2hpo4·12h2o 2.9g, tween-20（0.05%）0.5ml。蒸馏水加至1000ml。
7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，ph7.4 pbs。
8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制， 0.1m 柠檬酸（2.1g/100ml）6.1ml, 0.2m na2hpo4·12h2o（ 7 .163g/100ml）6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%h2o2 40ul。
9. 终止液：2mol/l h2so4。 蒸馏水178.3ml逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。
四. 操作步骤
1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔igg, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。