实验方法原理    实时荧光定量pcr技术，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实验材料    细胞样品
试剂、试剂盒    rna提取试剂盒荧光定量pcr mixtrizoldntp逆转录酶mmlvtaq酶depc水ddh2otemgcl2琼脂糖溴化乙锭mops甲醛乙酸钠edtaeb溴酚兰
仪器、耗材    离心管离心机风光光度计电泳槽凝胶板realtime pcr仪
实验步骤    
一、 样品rna的抽提
1.  取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2.  两相分离 每1 ml的trizol试剂裂解的样品中加入0.2 ml的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。rna全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的trizol试剂的60%。
3.  rna沉淀 将水相上层转移到一干净无rna酶的离心管中。加等体积混合以沉淀其中的rna，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4.  rna清洗 移去上清液，每1 mltrizol试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用depch2o配制），清洗rna沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5.  rna干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使rna沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6.  溶解rna沉淀 溶解rna时，先加入无rna酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的rna溶液保存于-80℃待用。
二、 rna质量检测
1.  紫外吸收法测定
先用稀释用的te溶液将分光光度计调零。然后取少量rna溶液用te稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定rna溶液 浓度和纯度。
（1）浓度测定
a260下读值为1表示40 ug rna/ml。样品rna浓度(μg/ml)计算公式为：a260 x 稀释倍数 x 40 ug/ml。具体计算如下：
rna溶于40 ul depc水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的te中，测得a260 = 0.21
rna 浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
取5 ul用来测量以后，剩余样品rna为35 ul，剩余rna总量为：
35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
（2）纯度检测
rna溶液的a260/a280的比值即为rna纯度，比值范围1.8到2.1。
2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定
（1）制胶
1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 x mops电泳缓冲液和18 ml的37% 。
10x mops电泳缓冲液
浓度  成分
0.4 m  mops，ph 7.0
0.1 m  乙酸钠
0.01 m  edta
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1xmops电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
（2）准备rna样品
取3 ugrna，加3倍体积的甲醛上样染液，加eb于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
（3）电泳
上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 v/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下观察并拍照
28s和18s核糖体rna的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提rna的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的rna（trna和5s核糖体rna）组成。在18s和28s核糖体带之间可以看到一片弥散的eb染色物质，可能是由mrna和其它异型rna组成。rna制备过程中如果出现dna污染，将会在28s核糖体rna带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，rna的降解表现为核糖体rna带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。
三、样品cdna合成
1.  反应体系
序号          反应物           剂量
1          逆转录buffer       2 ul
2         上游引物              0.2 ul
3         下游引物              0.2 ul
4          dntp                   0.1 ul
5       逆转录酶mmlv     0.5 ul
6         depc水              5 ul
7          rna模版            2 ul
8           总体积               10 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
2.  混合液在加入逆转录酶mmlv 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 ul，37℃水浴60分钟。
3.  取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cdna溶液，保存于-80℃待用。
四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量pcr
1.  β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 ul并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
2.  反应体系如下：
标准品反应体系
序号           反应物                           剂量
1       sybr green 1 染料             10 ul
2       阳性模板上游引物f              0.5 ul
3      阳性模板下游引物r              0.5 ul
4                 dntp                            0.5 ul
5                 taq酶                           1 ul
6           阳性模板dna                    5 ul
7              ddh2o                            32.5 ul
8               总体积                            50 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
3.  管家基因反应体系：
序号            反应物                                剂量
1      sybr green 1 染料                   10 ul
2      内参照上游引物f                         0.5 ul
3     内参照下游引物r                         0.5 ul
4               dntp                                    0.5 ul
5               taq酶                                   1 ul
6      待测样品cdna                             5 ul
7              ddh2o                                  32.5 ul
8             总体积                                    50 ul
轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。
3.  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的dna模板
1.  针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cdna模板进行pcr反应。
2.  反应体系
序号                     反应物                        剂量
1                     10× pcr缓冲液            2.5 ul
2                           mgcl2 溶液              1.5 ul
3                           上游引物f                 0.5 ul
4                           下游引物r                0.5 ul
5                            dntp混合液            3 ul
6                            taq聚合酶               1 ul
7                             cdna                       1 ul
8                    加水至总体积为               25 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个pcr循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?c延伸5分钟。
（3）pcr产物与 dna ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。
（4）将pcr产物进行10倍梯度稀释: 将pcr产物进行10倍梯度稀释: 设定pcr产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
六、 待测样品的待测基因实时定量pcr
1.  所有cdna样品分别配置实时定量 pcr反应体系。
2.  体系配置如下：
序号             反应物                                剂量
1            sybr green 1 染料               10 ul
2                上游引物                               1 ul
3                下游引物                               1 ul
4                  dntp                                   1 ul
5              taq聚合酶                               2 ul
6             待测样品cdna                        5 ul
7                   ddh2o                              30 ul
8                   总体积                               50 ul
轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。
（3）将配制好的pcr反应溶液置于realtime pcr仪上进行pcr扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
七、 实时定量pcr使用引物列表
引物设计软件：primer premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发dna 聚合反应(即错配)。
八、电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行realtime pcr反应。pcr产物与 dna ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，goldview染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。
收起 
注意事项    
1.荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准（即pcr扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上，但实际应用要结合扩增效率，线性回归系数等参数来综合考虑。
2.ct值：在pcr扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。ct值具有极好的重复性。
其他    
实时荧光定量pcr技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量pcr无需内标是建立在两个基础之上的：
1）ct值的重现性pcr循环在到达ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的ct值是恒定的。
2）ct值与起始模板的线性关系由于ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量pcr是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量pcr是迄今为止定量最准确，重现性、的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。