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定量 ELISA 技术的延伸和新的发展

2019/3/15 8:32:30发布68次查看
     在免疫学领域中,对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答(b细胞免疫),细胞介导的免疫应答(cell mediated immune response,cmi)也是人们所关注的,而t细胞在cmi中起关键作用。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法(elisa)检测体液中游离的细胞因子(ck)或抗体,但由于游离的循环抗体或ck的半哀期不同,使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合,而不能确切的反映体内的抗体及ck的水平。 80 年代,国外的科研工作者根据 elisa 技术的基本原理,建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和 ck 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术( elispot )。作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay,elispot),是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(asc) 或分泌细胞因子(ck) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法具有较高的特异性和敏感性,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低,已被广泛用于分泌ck细胞检测或asc测定中,对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
elispot 法源自 elisa,又突破传统 elisa 法,是定量 elisa 技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白,它们zui大的不同在于:
(1) elisa通过显色反应,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
(2) elispot也是通过显色反应,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接在显微镜下人工计数斑点或通过elispot 分析系统对斑点进行计数,1个斑点代表1个细胞,从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。(某些研究不仅要测细胞因子生成量,还需检测分泌此细胞因子的细胞频率)
由于是单细胞水平检测, elispot 比 elisa 和有限稀释法等更灵敏,能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素单抗,在研究者以刺激剂激活细胞时,不会影响活化细胞分泌细胞因子。
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