| 品牌班德液氮罐 | 型号1 |
| 容积1m3 | 重量1kg |
| 材质1 | 规格1 |
| 类型运输储罐 | 适用物料1 |
| 壁厚1mm | 高度1 |
| 直径1 |
为脐血造血干细胞(cbhsc)的冻存建立简便有效的方法,采用5%二甲基亚砜(dmso)加6%羟乙基淀粉(hes)为冷冻保护剂,不用程控降温装置,直接置cbhsc于-80℃冰箱中降温,次日移至液氮容器www.yedanguan365.com液中保存1周、1个月、3个月、6个月.结果冻存6个月后,单个核细胞(mnc)、粒-单系造血祖细胞(cfu-gm)和cd+34细胞的回收率及mnc的台盼蓝拒染率分别90.5±1.7%,87.6±19.5%,91.9±2.9%,75.8±1.8%.认为这一简便的方法能很好地保存cbhsc的造血潜能,因此它能为脐血移植冻存cbhsc.
脐血造血肝细胞(cbhsc)的冷冻保存是脐血移植工程中的重要环节之一，使用10%二甲基亚砜(dmso)为cbhsc冷冻保护剂，程控降温-液氮容器保存时采用多年行之有效的标准方法。但其成本昂贵，操作复杂，难以普及。本实验采用-80℃冰箱降温-液氮容器冻存cbhsc,取得了满意结果,现报道如下:
1 材料和方法
1.1 主要试剂及材料 冷冻保护剂cp-1溶液(日本极东制药厂工业株式会社),正常人血清白蛋白(卫生部上海生物制品研究所),淋巴细胞分离液(上海试剂三厂),methocult tmcf h4534(stem cell technologies inc,canada),rpmi1640培养基(gibco,usa),低温冷冻管(creiner ,cennany),含acd-b的采血袋(上海血液中心)。
1.2 脐血样本的来源 脐血样本由广西医科大学一附院产科-基金项目：广西壮族自治区教育厅自然科学基金(96048)资助提供。收集对象为无急，慢性感染及血液系统疾患的非高危妊娠产妇，且其新生儿为足月顺产，出生后皮肤红润，无感染征象。采集方法：新生儿娩出后，立即断脐，消毒脐带侧，行脐静脉套管插管，脐带血借宫缩力及位差重力作用流入血袋内(内含acd-b液50ml)，摇动混匀，直至无脐血流出为止。
1.3 脐血单个核细胞(mnc)的制备 acd-b液抗凝的脐血用rpmi 1640培养液等倍稀释后，置淋巴细胞分离液(1.077g/ml)的液面上，以2500 r/min,弃上清液，吸取界面层白细胞，用rpmi 1640培养液洗涤两次后，加入含10% ab型血清的rpmi 1640培养液，制成所需浓度的mnc悬液。
1.4 脐血mnc的冷冻保存及融冻
1.4.1 冷冻保护液的制备 脐血冻存时临时配制冷冻保护液，方法是：先将人血清白蛋白(alb,粉剂)加入生理盐水，制成25%人血清白蛋白溶液;按人血清白蛋白溶液与cp-1 容积比为32:68的比例，加入适量的cp-1溶液(成品每瓶68ml，含dmso10g和hes12g)中，并在冰上缓慢混匀。此时冷冻保护液的dmso，hes，alb浓度分别为10%，12%及8%。
1.4.2 冻存 将等体积的mnc悬液(浓度1.05 ~2.14×10 /ml)和冷冻保护液分别装入两支试管中，置冰水杯中预冷，待温度平衡后，将冷冻保护液缓慢加入细胞悬浮液中，边加边混匀(此步骤在冰水上操作)，待冷冻保护液全部加完并充分混匀后(此时，冷冻保护剂的终浓度为5%dmso 6%hes 及 4% alb)，分装入容积为2ml的数支低温冷冻管中，每管装1.8ml，旋紧管帽，置冰水中平衡20min，随后直接放入-80℃非控程冰箱降温,次日从冰箱中取出,移至液氮容器液相中保存.于1周,1个月,3个月,6个月后自液氮容器中取出融冻。
1.4.3 融冻 将上述冻存的样本小管从液氮容器液中取出，迅速置40℃水浴中复温至全部融化(约3min)后，将此冻存液用含10%人ab型血清的rpmi 1640培养液缓慢稀释5倍后，留出部分冻存液作mnc和cd+34细胞计数及台盼兰染色，其余部分以1500r/min 离心10min，弃上清液，用rpmi 1640培养液洗涤2次，加入含10%ab型血清的rpmi 1640培养液，制成所需浓度的mnc悬液，供cfu-gm测定。
1.5 观察指标
1.5.1 mnc计数 用3%醋酸作细胞稀释液，在低倍镜下计数mnc，计算mnc的回收率。
1.5.2 台盼兰拒染试验计数 0.2%台盼兰生理盐水液与细胞悬液等量混合，2min后在高倍镜下计数每100个mnc排斥台盼兰的存活细胞数。
1.5.3 cfu-gm测定 用甲基纤维素素法测定cfu-cm。冻存前后接种mnc悬液浓度均为1×10/ml,每份将mnc悬液0.25ml加入2.25ml的methocult tmcf h4534(该培养体系每毫升imdm液中含0.9%甲基纤维素，30%胎牛血清，1%牛血清，10m2-硫基乙醇，2-mml-谷胺酰胺，50ng rh scf,10ng rh gm-csf, 10ng rh il-3)中,混匀后，于每个直径为25mm的玻璃培养皿接种0.5ml(含mnc 0.5×10)，共3皿。放入37℃，5%co和全饱和湿度的恒温培养箱10天，在倒置显微镜下计算cfu-gm的生长集落(≥50个粒单系细胞的细胞团为一个集落)数，每份取其3个培养皿集落的均数，计算cfu-gm的回收率。
1.5.4 cd+34细胞计数 用碱性磷酸酶-抗碱性磷酸敏法。将mnc悬液制成离心涂片，固定后分别加(cd+34) 第一，第二，第三，抗体及底物显色液各20?l室温湿盒内作用各60(第一抗体)及30min，其间各以pbs缓冲液冲洗3次，***后苏木素复染，高倍镜下计数1×10?个mnc中，所含cd+34细胞(以细胞膜或细胞浆内有红色标记物着染为阳性)数，计算cd+34细胞回收率。
2 结果
见表1.
3 讨论
近年来骨髓及外周血干细胞的冻存出现了简易的趋势 1 ，即使用dmso联合hes作为hsc的冷冻保护剂，深低温冰箱非程控制降温冻存，并取得了与标准方法类似的结果5，但该方法应用于冻存cbhsc的报道甚少。
表1 脐血 mnc在液氮容器中保存不同时间结果
本实验采用5%dmso,加6%hes作为cbhsc的冷冻保护剂，与-80℃冰箱非程控制温后，移至液氮容器液中保存。保存6个月后，mnc,cfu-gm及cd+34细胞的回收率为90.5±1.7%，87.6±19.5%，91.9±2.9%，台盼兰据染率为75.8±1.8%，与broxmeyer等⑹报道的使用10%dmso作冷冻保护剂，程控降温后液氮容器保存cbhsc的结果一致。笔者认为-80℃冰箱非程控降温-液氮容器保存cbhsc可获得良好的效果。
与标准的方法比较具有下列优点：
①.dmso与hes联合用作冷冻保护剂,能发挥协同作用，减少dmso用量，因而可减轻dm-so对人体及造血细胞的毒性作用3.7。katayama等人⑷试验摆明5%dmso至少在融冻后1h内不会对造血干细胞造成毒性影响，这给融冻后造血干细胞的处理提供了时间的保证;
②.可避免程控降温的时间消耗及复杂的操作;
③可节省购买程控降温设备的费用;
④与-80℃冰箱直接冻存法比较，可克服由于供电不稳所带来的麻烦，为脐血移植提供了cbhsc冻存的新途径。本次试验冻存cbhsc的方法短期内可为脐血移植冻存cbhsc，但其长期冻存的效果尚待进一步观察。
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王女士
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