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引物设计的帖子不少，以前很多战友会推荐oligo、primerpremier、dna man等等软件。这些软件设计完最后还是要去blast比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法，觉得好的话请投个票。
就以人的pten基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是cdna，就找它的mrna序列。如果你要做的是dna，就找dna的序列。
以cdna为例，普遍的一种方法是上pubmed中gene栏搜索找到cdna那栏，但pubmed导出序列不太方便，我介绍个网站 asia.ensembl.org/index.html
1. 输入目的基因，进入
2.在左侧栏选择transcript，选择后进入
3. 选择pten-001中的transcript进入，点击左侧cdna
4. 然后点击configure this page进入设置你要显示的内容
5. 除了第一栏showexons选择yes外，其他的都选择no，然后取个名字保存save configuration as
6. 然后在左侧栏点击downloadview as rtf可下载你要的cdna序列，这个文件可以用word打开，不同的颜色代表一个外显子间断
下载后打开的word
7. 然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第6和第7外显子分别设计上下游引物。选取并复制第6和第7外显子序列
8. 登陆ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，粘贴这段序列，设置好range和pcr产物的大小，然后在下面点击get primers，可以在线设计并比对引物
9.最后选择一个比较特异性的引物，条带大小要尽量单一，其他的基因序列尽量不要比对到