实验材料sd大鼠
试剂、试剂盒小牛血清dmem酶消化液d-hanks' 液酚红台盼兰hbss氯化钠pbs
仪器、耗材手术刀手术剪尼龙网相差显微镜荧光显微镜
实验步骤
一、实验材料准备
1. 动物：雄性sd大鼠(体重250-450 g)。
2. 试剂：，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，dmem，酶消化液i、ⅱ(以hbss配)，18% nycodenz(以gbss配)，d-hanks' 液(kcl 0.4 g/l，kh2po4 0.06 g/l，nacl 8.0 g/l，nahco3 0.35 g/l，na2hpo4·7h2o 0.06 g/l或na2hpo4 0.053 g/l，可加酚红 0.02 g/l)，hbss，台盼兰等。
3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。
二、原代培养方法
1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以d-hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液i(0.05% iv型胶原酶)。
2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液ii(含20 u/ml dnase i的0.05% iv型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
3. 以hbss重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml hbss，1450 g离心16 min后取界面细胞。
4. 以hbss重悬后再次离心收集细胞，以dmem重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
三、传代方法
弃去培液后以d-hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代加0.05% edta)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(dmem+10% nbs)终止反应(若不用edta，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%co2，37℃)。
四、 结果
接种次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm处见自发荧光。附上发表于biochem biophys res commun 2004年文章的照片(图1)。
注意事项
1. 进一步鉴别需要做免疫组化：desmin和α-sma；后者在细胞激活后才表达。
2. 采用无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！实验采用原代培养的或传代后9代内的细胞(5代以内)。
其他
一、参考文献
1. 袁桃霞，张锦生，张月娥，等. 大鼠肝ito细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察. 上海医科大学学报 1996;23(2):90-93.
2. huang gc, zhang js, tang qq. involvement of c/ebp-α gene in in vitro activation of rat hepatic stellate cells. biochem biophys res commun 2004;324(4):1309-1318.