pcr的要素基本的pcr须具备1.要被复制的dna模板 template2.界定复制范围两端的引物primers.3.dna聚合酶taq. polymearse4.合成的原料(四种脱氧核苷酸)及水。
实验室使用的pcr仪都是高精度仪器,一旦仪器出现一些温度或者检测上的小偏差,很可能对实验结果产生较大的影响,所以我们在日常使用pcr仪的时候,要注意对其的保养:
1. 仪器安置
仪器应安放在湿度较低、灰尘较少并远离水源和热源的地方,无腐蚀性气体或强磁场干扰。环境温度建议在18-35℃之间。仪器之间应保持50cm以上距离,降低仪器之间的影响。
2.样品台、热盖定期清洁
用95%乙醇配合棉签、无尘布等工具,清洁样品台。之后运行pcr仪,设定保持温度为50℃,约5-10min,让残余液体挥发去除。
另外,热盖也应该用酒精或纯水定期清洗,确保热盖清洁,温控性能良好。对于荧光定量pcr,清洁样品台和热盖的同时,去除灰尘等杂物,保证光路清洁,降低信号干扰。
pcr仪是一种利用dna聚合酶对特定基因做体外或试管内invitro的大量合成,基本上它是利用dna聚合酶进行专一性的连锁复制。因而,在pcr仪使用时对于环境要求很高,为了避免实验未完成前可能出现的任何污染反应液的情况,应该了解关于反应液受到污染时,反应液处理方法:
紫外照射法:未加模板和taq聚合酶的pcr混合液进行紫外照射,注意事项与方法同上述uv照射法;
内切酶法:选择识别4个碱基的内切酶(如msp i和taq i等),可同时选择几种,以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷,室温作用1h 后加热灭活进行pcr;
dnase i法:pcr混合液(未加模板和taq聚合酶)加入0.5u dnase i,室温反应30 min后加热灭活,然后加入模板和taq聚合酶进行正常pcr扩增。该方法的优点是不需要知道污染dna的序列;
g射线辐射法:1.5kgy的辐射可完全破坏0.1ng基因组dna,2.0 kgy可破坏104拷贝的质粒分子,4.0 kgy仍不影响pcr,但高于此限度会使pcr扩增效率下降。引物可受照射而不影响pcr,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏dna的。
pcr仪的使用要求很高,因此不允许在实验过程中出现一丝错误,尤其是任何与实验有关的物品的污染情况。上述关于pcr仪反应液污染情况的及时处理方法一定能帮助您在实验中出现类似情况时及时处理。
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