【预期用途】
本产品为沙门氏菌、志贺氏菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法），可对沙门氏菌、志贺氏菌进行定性检测，通过实时扩增曲线判断样品中是否含沙门氏菌或志贺氏菌，适用于沙门氏菌或志贺氏菌的辅助检测。
【检验原理】
本试剂盒采用恒温扩增技术，通过bst聚合酶及特异性引物在恒温条件下对沙门氏菌、志贺氏菌核酸片段进行特异性扩增，扩增产物（dna）与核酸染料结合后发出荧光信号，根据所产生的扩增曲线判断结果。
【主要组成成份】
组分名称
规格×数量
dna提取液
1.6 ml×2支
反应液（ss）
550 μl×1支
bst聚合酶
30 μl×1支
密封液
500 μl×1支
阳性对照（ss）
10 μl×1支
阴性对照
10 μl×1支
说明书
1份
【储存条件及有效期】 本试剂盒保存于-18~-25℃，有效期为12个月。
【自备材料】
1）增菌液；2）0.8%nacl水溶液或医用生理盐水；3）灭菌1.5ml或2.0ml带旋盖的离心管；4）灭菌0.2mlpcr管及枪头；5）碎冰或冰盒；6）微量移液器（0.5～10μl，10～100μl，100～1000μl）；7）离心机；8）涡旋振荡器。
【适用仪器】 esetubescanner，荧光pcr仪（abi7500，cfx96，mx 3005p等），genieii等扩增仪。
【检验方法】
1．样品前处理
参照国家标准、sn标准或其他方法进行前增菌。
2．模板制备
1）取增菌液1~2 ml，12000 rpm 离心5min，弃上清；
2）加入500μl0.8%nacl水溶液或医用生理盐水，12000rpm离心5 min，尽量弃净上清液；
3）沉淀中加入100μldna提取液，涡旋混匀，100℃加热10 min，加热后迅速冷却（置于-20℃冰箱）10 min；
4）12000rpm离心2min，将上清转移至新的离心管中备用（2μl上清用于核酸扩增）。
3．试剂配制（在准备区进行，与扩增区分开，冰上操作）
若有n个待检样品，需配制n+2个反应（n个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照），将下表中试剂在ep管中混匀，按每管23μl分装至0.2mlpcr管中。
试剂
加入量（μl）
反应液（ss）
22 ×（n+2）
bst聚合酶
1.0 ×（n+2）
总体积
23 ×（n+2）
4．加样（在标本处理区进行，冰上操作）
在上述含有混匀试剂的pcr管中加入2μl模板（加样顺序为阴性对照、待检样品、阳性对照），随后加入20μl的密封液（如扩增仪器带热盖可不加密封液），3000rpm离心30s。
5．扩增反应（在扩增区进行）
63℃反应30 min。
根据使用的仪器设备，设置相应参数。
1) 如使用ese tube scanner，按如下方法设置反应条件：
acquisition设置：
testtime[min]：30，scaninterval：30s，mixafter[s]：0，temperature[℃]：63，equiltime[s]：30
evalution设置：
在fam通道下，选定slopevalidation，star[min]：0，end[min]：29，period[points]：4，slope[mv/min]：30。然后在tamra通道中，把‘slopevalidation’选项前的复选框标记成未选定状态。
normalization设置：
温度设置成63℃后，单击‘setcontrolon’，待仪器温度升到63℃后，按对应顺序将上述反应管放入仪器内，点击‘开始’按钮开始反应。
2) 如使用荧光pcr仪，请选用fam通道，可参考图1设置反应程序，将63℃15s，63℃45 s作为一个循环，于63℃ 45s处收集荧光信号，30个循环；
3) 如使用其他仪器请根据仪器说明书进行设置。
图1 荧光pcr反应程序设置
6．结果检测
若有“s”型扩增曲线，则判断为阳性（含沙门氏菌或志贺氏菌）；若无“s”型扩增曲线，则判为阴性（不含沙门氏菌及志贺氏菌），结果判断图详见图2。
图2 检测结果示意图
7．质量控制
要求阴性对照品显示阴性（无“s”型扩增曲线），阳性对照品显示阳性（有“s”型扩增曲线），否则检测结果无效。
【注意事项】
1．请严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。
2．试剂和标本准备阶段在生物安全柜内操作，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器，试验产生的所有废弃物均按照医疗废弃物处理。
3．试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前在3000rpm离心30秒。
4．反应结束后，开盖易造成气溶胶污染，切忌开盖。
5．不同批号试剂请勿混合使用，请在有效期内使用试剂盒。
6．本试剂盒仅供科研使用，请勿用于其他用途。
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王文达
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