口蹄疫病毒实时荧光qrt-pcr检测试剂盒
一、简介
口蹄疫病毒实时荧光qrt-pcr检测操作说明书是按照参照oie《manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals 2009》国际标准和《中国国家标准口蹄疫病毒荧光rt-pcr检测方法》（gb22915-2008）而制备的商业化检测试剂盒。能对样品中口蹄疫病毒进行快速检测，具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。
二、用途
本试剂盒适用于检测发病动物血清、水泡液、淋巴结等标本以及细胞培养液中所有血清型(包括a、o、c、南非1、南非2、南非3和亚洲1型)口蹄疫病毒(fmdv)rna；适用于口蹄疫病毒感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供参考。
三、试剂盒组成（40t/kit）
组成成份
数量
规格
口蹄疫荧光qrt-pcr反应液（fmdv-qrt-pcr mix）
1管
560μl/管
酶混合物（enzymes mix）
1管
40μl/管
无核酸酶水（nuclease-free water）
1管
500μl/管
阴性对照 （ntc）
1管
50μl/管
阳性对照 （fmdv-ptc）
1管
50μl/管
四、储存条件及有效期
本试剂盒于-18℃以下保存，有效期为6个月。
五、荧光pcr仪器适用范围
abi系列，roche系列等荧光定量pcr检测仪等。
六、样品的采集与rna提取
6.1 样品的采集
按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-80℃，但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。
6.1.1 血清：用一次性无菌注射器抽取静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温（22-25℃）放置30-60min，血标本可自发完成凝集析出血清，或直接使用水平离心机，3000rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
6.1.2 血浆：用一次性无菌注射器抽取静脉血2ml，注入含edta（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后即可分离出血浆，转移至1.5ml灭菌离心管。
6.1.3 拭子、分泌物等样品：在装有拭子或分泌物的离心管中加入500µl pbs或生理盐水，剧烈振荡30s。棉拭子尽量挤出液体转移到无rna酶污染的离心管中，6000rpm离心20s，取上清备用。
6.1.4 病灶组织样品：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨（最好置于冰上或加入液氮），再加1ml生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5ml灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5ml灭菌离心管中。
6.2 样品rna提取
采用亿森宝生物试剂盒提取病毒rna。
注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸（无需提取），直接取5µl加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。
七、检测步骤
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qrt-pcr反应液（fmdv-qrt-pcr mix）、酶混合物（enzymes mix），冰上融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。
设所需要的pcr反应管管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
试剂
每个反应加入的量
n个反应加入的量
荧光pcr反应液
14µl
n ×14µl
酶混合物
1 µl
n × 1 µl
总量（total volume）
15µl
n ×15µl
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的n个pcr反应管中分别加入15μl，向每管中加入处理后样品/阴性对照（ntc）/阳性对照（fmdv-ptc）5μl，10,000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qrt-pcr反应条件
将各反应管放入实时荧光pcr仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
反转录（reverse transcription）
1循环
45°c for 5 min
预变性
1循环
94°c for 30 sec
pcr扩增（pcr amplification）
40循环
94°c for 5 sec
60°c for 30 sec
在60°c 延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为fam。
八、结果分析
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判定
阴性对照（ntc）：不应产生任何的扩增曲线。 
阳性对照（fmdv-ptc）：均产生扩增曲线。
以上条件应同时满足 ，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
在试验成立的条件下，ct值≤35的样本为阳性，表明fmdv核酸阳性。
ct值显示为无的样本为阴性样本，表明fmdv核酸阴性。
如果35＜ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行fmdv qrt-pcr检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明fmdv核酸阳性；否则判为样本阴性。
九、注意事项
①　初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
②　所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含rna酶。
③　pcr操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、pcr扩增区等)，防止实验室污染。
④　样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
⑤　试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。z

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